Токсикологическая оценка передозировки гидроксихлорохина на эмбрионах рыбок данио (Danio rerio)

Дефекты роста, вызванные HCQ

смертность

Смертность эмбрионов рыбок данио через 8 часов после оплодотворения (HPF) и через 1 день после оплодотворения (DPF), 2 dpf, 3 dpf и 4 dpf при 0 мкМ, 12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ HCQ, который вводили при 0 л.с.

Суммарная смертность контрольной и опытной групп при концентрациях HCQ не выше 50 мкМ оставалась низкой (p > 0,05) и составляла: 0 мкМ (0,0%), 12,5 мкМ (5,9%), 25 мкМ (3,6%) и 50 мкМ. мкМ (0,0%). До завершения 1 dpf смертность экспериментальной группы при концентрациях выше 50 мкМ оставалась низкой. Однако при достижении 1 dpf кумулятивная смертность при 100 мкМ значительно увеличилась до 26,8% (p < 0,05). Смертность при 200 мкМ значительно увеличилась до 81,2% при 1 dpf, 89,6% при 2 dpf и достигла максимума 93,8% при 3 dpf (p <0,05) (рис. 1а).

Кривые выживания эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию различных концентраций HCQ от 8 часов до 4 дней после оплодотворения. Линии разных цветов представляют разные группы, а зеленый цвет представляет контрольную группу. (а) Для проверки статистической значимости использовали непарный t-критерий *P <0,05; **р < 0,01; ***Р < 0,001; ****P <0,0001, как показано ниже. (Б—еНа фото примеры аномалий развития. Масштабные линейки, 100 мкм.

искажение

При этом было установлено, что плоды в контрольной группе развиваются нормально во все периоды воздействия. В группе HCQ развились аномалии при концентрациях выше 50 мкМ. Как показано на рисунке 1B-E, эти аномалии включали аномалии хвоста, сколиоз, аномалии желтка, задержку развития, отек перикарда и аномалии глаз, причем последние два были наиболее очевидными. Подобно эффекту, наблюдаемому с точки зрения смертности плода, тяжесть пороков развития, включая отек перикарда, аномалии желточного мешка и глазные аномалии, увеличивалась с увеличением концентрации HCQ. Плоды, подвергшиеся воздействию 200 мкМ HCQ, показали наиболее серьезные отклонения.

скорость вылупления

На 3 dpf процент вывода в контрольной группе составил 89%. При концентрациях HCQ ниже 50 мкМ скорость вылупления составляла 71% (12,5 мкМ), 91% (25 мкМ) и 68% (50 мкМ). При концентрациях более 50 мкМ скорость вылупления быстро снижалась до 32 % (100 мкМ) и 6 % (200 мкМ) (рис. 2б), что может быть связано с повышенной смертностью эмбрионов (26,8 % при 100 мкМ, 93,8 % )% при 200 мкМ) (рис. 1а) при аналогичных концентрациях HCQ. При скорости 96 hpf у всех живых эмбрионов болезнь Крона отсутствовала (рис. 2б).

(а) Диаграмма рассеяния и статистические результаты для подсчета хвостовой катушки при 1 dpf. (Б) График рассеяния и статистические результаты скорости вылупления при 3 dpf. (с) Диаграмма рассеяния и статистические результаты частоты сердечных сокращений при 4 dpf. (доктор) Диаграмма рассеяния и статистические результаты для длины тела при 5 dpf.

частота сердцебиения

Частоту сердечных сокращений эмбрионов рыбок данио регистрировали на 4 днях в минуту. Для этого у отобранных плодов из каждой группы регистрировали частоту сердечных сокращений в течение 20 с после стабилизации сердцебиения плода при комнатной температуре в течение 10 мин.⁹.

Частота сердечных сокращений контрольной группы составила 139,4 ± 8,1 уд/мин, которая увеличилась до 172,8 ± 24,7 (6,25 мкМ), 198,5 ± 41,0 (12,5 мкМ), 252,3 ± 37,4 (25 мкМ), 239,4 ± 36,4 (50 мкМ). и 232,4 ± 25,8 (100 мкМ) ударов в минуту после воздействия HCQ, демонстрируя, что HCQ влияет на сократительную способность сердца эмбрионов рыбок данио.

Эти результаты показывают, что HCQ значительно увеличивает частоту сердечных сокращений эмбрионов рыбок данио (p <0,05) в зависимости от дозы. Однако эффект был медленнее при концентрациях выше 25 мкМ, что может быть следствием кардиотоксического потенциала высоких концентраций HCQ.^10,11 (рис. 2в).

Длина тела

Было обнаружено, что длина тела рыбок данио уменьшается с увеличением концентрации HCQ при 5 dpf. В то время как длина тела рыбок данио в контрольной группе составляла 3,8 ± 0,1 мм, в опытной группе — 3,6 ± 0,1 мм (12,5 мкм), 3,7 ± 0,1 мм (25 мкм), 3,6 ± 0,1 мм (50 мкм), 3,6 ± 0,3 мм (100 мкм) и 3,3 ± 0,2 мм (200 мкм). Более того, экспериментальные группы, подвергшиеся воздействию 12,5 мкМ, 50 мкМ и 200 мкМ HCQ, значительно отличались от контрольной группы, при этом наиболее выраженное уменьшение длины тела наблюдалось при 200 мкМ (рис.

поведение

Спонтанные движения плода регистрировались в желточном мешке в течение 1 мин на 1 дпф (рис. 2а). Количество завитков хвоста в минуту в контрольной группе составляло 2,1 ± 1,4, что значительно отличалось от наблюдаемого при 25 мкм (2,4 ± 1,3 раза/мин) и 100 мкм (2,4 ± 1,5 раза/мин). В то время как группа 50 мкМ (3,0 ± 1,3 раза/мин) показала значительное (p <0,005) увеличение, группа 200 мкМ (0,8 ± 1,2 раза/мин) показала значительное снижение (p <0,05).

Как видно из дополнительного видео 1, движения личинок с точки зрения расстояния и скорости плавания в группе HCQ показали сниженную реакцию на внешние раздражители по сравнению с таковыми в контрольной группе на 3 дпф. Этот эффект становился все более очевидным при увеличении концентрации HCQ.

Кроме того, заменив экспериментальный раствор группы 50 мкМ HCQ на ту же яичную воду, что и контрольная группа, через 3 dpf, мы наблюдали восстановление реакции на внешние раздражители через 4 pdf (через 24 часа). Следовательно, можно сделать вывод, что HCQ мешает, хотя это может быть устранено спонтанными движениями рыбок данио.

Гибридизация на месте

Чтобы определить влияние HCQ на развитие эмбриональной ткани рыбок данио, наблюдали за контрольными группами, а также группами, обработанными 50 мкМ и 100 мкМ HCQ.

Через 5 часов после оплодотворения полная гибридизация in situ (WISH) показала заметное увеличение маркеров дорсальных регуляторов. ГСК И ЧД У эмбрионов, подвергшихся воздействию 50 мкМ и 100 мкМ HCQ на стадии щита (p <0,05). В этих группах HCQ изменил судьбу вентральных дорсальных клеток и расширил дорсальную область, указывая на то, что он может регулировать дорсо-вентральную ось у рыбок данио. Напротив, выраженность вентрального признака канун 1 Он существенно не различался между группами 50 мкМ (р > 0,05), 100 мкМ (р > 0,05) и контрольной группой (рис. 3а).

Экспрессия маркера зародышевого слоя была обнаружена с помощью ISH во время гаструляции через 5 часов после оплодотворения (а) и 7 л.с.Б). Руководство: мы читаем И сокс17, вид сверху со столбиком животного вверх на стадии эпиболии 75%; Спинные виды животного с видом вверх: otx2; Другое, дисплей анималистического полюса (канун 1И ЧДИ ГСК И gata2a) спиной вправо. Диаграмма рассеяния справа соответствует статистическим результатам сигналов гибридизации. Масштабные линейки, 100 мкм.

Выражение метки на коже gata2a Он уменьшился по всей эктодерме на стадии экранирования (стадия 7 hpf) в группах 50 мкм (p <0,05) и 100 мкм (p <0,05), и у рыбок данио в этих группах наблюдалось значительное снижение развития эктодермы (рис. 3b). .

Кроме того, подобно наблюдению, сделанному для маркерных генов через 7 часов после оплодотворения, уровень экспрессии мезодермального маркера мы читаем В группе 50 мкМ он существенно не отличался (р > 0,05), но значительно увеличился в группе 100 мкМ (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Следовательно, 100 мкМ HCQ регулируют развитие мезодермы рыбок данио (Fig. 3b).

знак эндодермы сокс17 Передний нейроэктодермальный признак otx2 Он существенно не отличался между группами, получавшими 50 мкМ, и контрольной группой (P > 0,05), но был значительно снижен в группе, получавшей 100 мкМ (P <0,05). Следовательно, 100 мкМ HCQ регулируют развитие энтодермы рыбок данио (кишечник, печень и другие внутренние органы) и передней нейроэктодермы (Fig. 3b).

Prox1a Он является мишенью передачи сигналов β-катенин-TCF/LEF в глазу рыбок данио.¹²И Pax2a Он экспрессируется в нескольких структурах, включая незрелый глаз, мезодерму, нервную систему, нервный киль и капилляр. На 1 dpf уровни экспрессии Брукс 1 А И pax2a Он существенно не отличался между группами 50 мкМ и контрольной группой (p > 0,05), но был значительно снижен в группе 100 мкМ (p <0,05). Снижение экспрессии этих двух маркеров указывает на то, что HCQ снижает развитие глаза, нервной системы и почечной системы у рыбок данио (Fig. 4a).

(а) знаковое выражение на 24 л.с. Вид спереди слева. (БМорфология сердца (характеризуется панмиокардиальным признаком myl7) при 48 л.с. Ориентация плода: вентральный вид с передней частью сверху. Стрелки указывают на атриум. Красные линии показывают острый угол, образованный между аксонами предсердий и желудочков. График рассеяния справа соответствует статистическим результатам для углов.

Мыл7, сердечный маркер экспрессируется в кардиомиоцитах по всему сердцу. При 2 dpf выражение для myl7 Между контрольной группой, группами 50 мкМ (p > 0,05) и группами 100 мкМ (p > 0,05) не было значительных различий (рис. 4b).

Транскрипционный анализ

Молекулярный механизм обработки HCQ был проанализирован с точки зрения его влияния на уровни РНК плода рыбок данио с использованием анализа транскриптома (доступ NCBI SRA: PRJNA879284).

Обработка 50 мкМ HCQ привела к дифференциальной экспрессии 960 транскриптов, 581 из которых были активизированы, а 379 значительно активизированы по сравнению с таковыми в контрольной группе (рис. 5а и дополнительная таблица 1).

(а) Общая статистика по дифференциальным генам. (Б) существенно дифференцированы гены, связанные с развитием сердечно-сосудистой системы. (с) значительно отличающиеся гены, связанные с развитием глаз и зрительного нерва. (доктор) Количество значительно дифференциально экспрессируемых генов биологических процессов, клеточных компонентов и молекулярных функций. (е) значительно отличающиеся гены, связанные с развитием нервной системы.

Анализ обогащения Gene Ontology (GO) показал, что экспрессия генов, связанных с 24 биологическими процессами, 16 клеточными компонентами и 11 молекулярными функциями, была значительно изменена (рис. 5d). Среди генов, участвующих в биологических процессах, 1322 гена проявляли повышенную экспрессию, а 1489 — пониженную экспрессию. Было обнаружено, что число активированных и регулируемых генов, связанных с клеточными компонентами, составляет 1062 и 801 соответственно. Были активированы дополнительные 518 генов, и 424 гена были активированы среди генов, связанных с молекулярными функциями (рис. 5d и дополнительная таблица 2).

Учитывая результаты ISH и аномальное развитие рыбок данио в результате обработки HCQ, мы специально проанализировали транскрипцию определенных систем. Результаты выявили значительные различия в 53 генах, связанных с развитием сердечно-сосудистой системы, между группами HCQ и контрольной группой, из которых 26 генов были активированы, а 27 генов были активированы (рис. 5b и дополнительная таблица 3).

Кроме того, были обнаружены значительные различия в экспрессии 16 генов, связанных с развитием глаз, между группами HCQ и контрольной группой, в которой пять генов были активизированы, а 11 генов подавлены (рис. 5C и дополнительная таблица 4). Мы обнаружили значительные различия в 91 гене, связанном с развитием нервной системы, в группе HCQ по сравнению с контрольной группой. 46 генов были активизированы, а 45 генов подавлены (рис. 5E и дополнительная таблица 4).

Чтобы охарактеризовать функции этих дифференциально экспрессируемых транскриптов, был проведен классификационный анализ на основе пути Киотской энциклопедии генов и генома (KEGG) для онтологии клеточных процессов, обработки информации об окружающей среде, обработки генетической информации, болезней человека, метаболизма и органов. системы. . Это показало, что только путь регуляции долголетия был значительно обогащен у эмбрионов, обработанных HCQ, по сравнению с таковым у контрольных эмбрионов (рис. 6 и дополнительная таблица 5). Предыдущее исследование продемонстрировало усиление процессов окислительного стресса у рыбок данио из-за воздействия HCQ.¹³. Мы нашли два гена, а именно nfe2 И pxdn, которые участвуют в процессе окислительного стресса. ген nfe2 Он также участвует в путях развития рака, сердечно-сосудистых заболеваний и старения; Однако ни один из этих путей не был значительно обогащен (дополнительная таблица 6).

Топ-20 обогащенных треков KEGG, трек, отмеченный красной пунктирной рамкой, является единственным значительно обогащенным треком.