Микроскоп ExA-SPIM ускоряет визуализацию головного мозга

Мозг млекопитающих представляет собой многодоменную систему. Нейронные цепи образуют супермагистраль к информации, причем некоторые проекции потенциально могут проникать в мозг на десятки сантиметров. Но эти выступы также имеют толщину в несколько сотен нанометров — примерно одну тысячную ширины человеческого волоса.

Понимание того, как мозг кодирует и передает сигналы, требует согласования событий на обеих шкалах. Традиционно исследователи мозга решали эту проблему, используя многоэтапный процесс: разрезание ткани на тонкие срезы, визуализация каждого среза с высоким разрешением, повторное соединение слоев и реконструкция траекторий отдельных нейронов.

Чжухао Ву, нейробиолог из Weill Cornell Medicine в Нью-Йорке, описывает этот последний шаг как «отслеживание телефонного провода на Манхэттене». На самом деле это «гораздо сложнее», добавляет он, «потому что каждый нейрон образует тысячи, если не десятки тысяч соединений».

Создатели микроскопов стремились дать исследователям возможность взглянуть под широким углом на большой участок ткани и при этом увидеть детали вблизи, без необходимости сначала нарезать ткань, а затем реконструировать аксоны на разных участках. Проблема заключается в том, что объективы микроскопа, как правило, сконструированы таким образом, что трудно получить изображения больших образцов с высоким разрешением.

Первоначальная версия, опубликованная в июне, предлагает решение¹. Во-первых, исследователи химически удалили жир, чтобы сделать ткань прозрачной. Затем они включили его в материал, называемый гидрогелем, который поглощает воду, расширяя ткань в три раза по сравнению с ее первоначальным размером. Наконец, они просканировали его с помощью объектива, позаимствованного из совершенно другой области науки. Таким образом, можно было визуализировать весь мозг мыши без необходимости каких-либо вскрытий и с разрешением около 300 нм в плоскости изображения и 800 нм в осевом направлении (перпендикулярно плоскости), что аналогично конфокальной микроскопии. Широко используемый метод визуализации головного мозга с высоким разрешением. Протокол, получивший название ExA-SPIM (микроскопия плоского освещения с селективным расширением), также использовался для визуализации нейронов в мозге макак и человека.

«Самое замечательное, что дает такая система, — это возможность снимать очень большие объемы. [of brain tissue] «С очень высоким разрешением», — говорит Джаярам Чандрашекар, нейробиолог из Института нейродинамики Аллена в Сиэтле, штат Вашингтон, который руководил исследованием вместе с двумя коллегами: разработчиком микроскопа Адамом Глейзером и президентом института Карелом Свободой.

Этот подход позволяет визуализировать весь мозг мыши менее чем за день — гораздо быстрее и с более высоким разрешением, чем это возможно с другими методами исследования всего мозга, которые применялись для аксональных проекций, такими как MouseLight и fMost, которые используют томографию, говорит Чандрашекар. . Тот факт, что изображения требуют лишь ограниченной вычислительной реконструкции, значительно повышает точность полученных данных.

Ни один из компонентов системы не является новым, отмечает Ву — они просто объединены синергетическим образом. «Это не первая попытка сделать это, но это, вероятно, лучшая попытка, которую мы делаем прямо сейчас», — говорит он.

Шаг за шагом

Первый элемент протокола — удаление и расширение ткани — использовался в течение десятилетий, но обычно на небольших участках ткани. По словам Глейзера, команде пришлось улучшить технику, чтобы образцы мозга расширялись изотропно, то есть на одинаковую величину во всех направлениях.

По словам Глейзера, ядром нового метода является линза. Выбирая его, они посмотрели на отрасли машинного зрения и метрики и остановились на том, который обычно используется для выявления дефектов размера пикселя в плоских дисплеях и других электронных устройствах, когда они движутся по конвейерной ленте. Линза имеет большее поле зрения, чем обычно используется в науках о жизни, говорит он, а поскольку перед визуализацией ткань растягивается, разрешения в один микрометр достаточно, чтобы отследить аксон по всему мозгу.

Исследователи встроили эту линзу в микроскоп, который визуализировал 3D-структуры в виде серии 2D-панелей. Этот метод называется селективным освещением плоскости. Затем они добавили камеру, также полученную из индустрии технического зрения и метрологии, которая имеет в 38 раз больше пикселей, чем камеры, традиционно используемые в науках о жизни, и может захватывать поле зрения размером 10,6 мм x 8,0 мм. По словам Чандрашекара, с такими характеристиками двумерный лист увеличенного мозга мыши можно получить примерно за 15 разрезов по сравнению с 400 разрезами для обычного микроскопа.

Мощный микроскоп фиксирует моторные белки с беспрецедентной детализацией

«Мне понравилось, что они мыслили нестандартно и смотрели на другие области науки», — говорит Флави Лавуа-Карденаль, нейробиолог и микробиолог из Университета Лаваля в Квебеке, Канада. «Это лучший метод, чем методы с использованием специальных линз», — добавляет она, что делает систему менее доступной для других исследователей.

ExA-SPIM «определенно важен», говорит Кэтрин Виллиг, микроученый из Университета Георга Августа в Геттингене, Германия, особенно для изучения связей мозга или «нейронных связей». Но, добавляет она, «было бы неплохо немного улучшить разрешение, чтобы можно было четко видеть шипы дендритов».

Закопать данные

По словам Глейзера, один мозг можно визуализировать менее чем за день. На данный момент команда изучила мозг 25 или около того мышей, получив около 2,5 петабайт данных, которые команда сжимает в пять раз и сохраняет в облаке. Для анализа данных исследователи сотрудничают с Google, который предоставляет алгоритмы машинного обучения для обработки данных и реконструкции изображений нейронов.

Объем используемых данных может стать огромным препятствием для потенциальных пользователей, говорит Гарри Шрофф, микроскопист из Исследовательского кампуса Джанелия в Эшберне, штат Вирджиния. По его словам, помимо сложности анализа этого объема данных, просто перенести его с микроскопа на компьютер — это огромный подъем. «Ассоциации лабораторий или институтов могут инвестировать в людей, в силы или инфраструктуру для этого, но это немалый подвиг», — говорит он.

Умные микроскопы обнаруживают переходную биологию

Тем не менее, конструкция микроскопа находится в открытом доступе, а инструкции по его сборке — в свободном доступе. Доступно на гитхабе. Но Глейзер говорит, что текущая версия — это прототип, который он планирует оптимизировать и задокументировать в течение следующего года. «На сборку требуется время, и построить ее не так-то просто», — говорит он. На данный момент несколько лабораторий проявили интерес, но ни одна из них не пыталась настроить систему. «Мы будем перепроектировать и реконструировать микроскоп и очень хорошо документировать его — и мы надеемся получить финансирование для развертывания системы, чтобы другие группы могли ее использовать».

По словам Чандраскара, отслеживание долговременных нейронных связей — наиболее очевидное приложение, которое в настоящее время исследуют исследователи. Но они также перерабатывают протоколы очистки и расширения, чтобы сохранить жизненно важные молекулы, такие как РНК и белки, неповрежденными, а также позволить им локализоваться.

«Я с нетерпением жду возможности увидеть, как эта технология может принести пользу другим проблемам нейробиологии», — говорит Ву.