Технология Tricorder: PicoRuler: молекулярные линейки для микроскопии высокого разрешения.

Новейшие методы микроскопии сверхвысокого разрешения теперь достигают оптического разрешения порядка нескольких нанометров. Это соответствует разрешению в диапазоне размеров клеточных молекул. Однако пока не удалось проверить достигнутую точность на клеточных строительных блоках, таких как мультибелковые комплексы, поскольку не существовало биомолекулярных эталонных систем, которые можно было бы пометить красителями в точно определенных местах на расстоянии нескольких нанометров.

Команда под руководством доктора Герти Бильё и профессора Маркуса Зауэра из Центра Рудольфа Вирхова – Центра интегративной и трансляционной биовизуализации при Университете Юлиуса Максимилиана (JMU) Вюрцбург в Баварии, Германия, стала поворотным моментом. В журнале Advanced Materials они представляют новые биосовместимые молекулярные линейки PicoRulers (оптические линейки для калибровки изображений на основе белков).

Используя расширение генетического кода и клик-химию, команда успешно создала специальные молекулярные линейки. Их можно использовать в качестве точных биомолекулярных эталонных структур во флуоресцентной микроскопии.

Архитектура PicoRuler на базе PCNA для микроскопии со сверхвысоким разрешением менее 10 нм. А) Изображение конструкции линейки PCNA, показывающее положения трех одинаковых флуорофоров с интервалом 6 нм. Это было достигнуто за счет биоортогональной эпитаксии NCAA, которые были специально введены GCE в сайт PCNA. В качестве эталонного образца использовали PCNA, меченный DOL ≈0,4. Б) SDS-PAGE, показывающий чистоту WT PCNA после каждого этапа очистки. L: белковая лестница, His: после никелевой аффинной хроматографии, Strep-Trap: после аффинной хроматографии со Strep-меткой и SEC: после эксклюзионной хроматографии. Полоса мономера PCNA отмечена красным треугольником. C) PCNA-6(S186Norb), полученный с помощью ПЭМ при отрицательном окрашивании уранилацетатом. D) SEC-хроматограмма PCNA-6 (S186Norb) после мечения H-Tet-Cy5, подтверждающая успешную конъюгацию флуорофоров с белком PCNA. Фракция, содержащая помеченный PicoRuler, показана синим цветом. Масштабная линейка 5 нм (в) — Передовые материалы

Технологический шедевр: точность на молекулярном уровне

PicoRulers основаны на трехкомпонентном белке PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток), который играет ключевую роль в репликации и восстановлении ДНК. Осторожно вставив неприродные аминокислоты в точно определенные места, этот белок был модифицирован таким образом, что он может эффективно воздействовать на флуоресцентные красители или другие молекулы с минимальной ошибкой связывания.

Это позволяет исследователям проверять точность новейших методов микроскопии сверхвысокого разрешения с беспрецедентным разрешением на точно определенных клеточных биомолекулах.

Маркус Зауэр с энтузиазмом говорит: «Способность анализировать реальные биологические структуры на уровне менее 10 нм представляет собой новую эру в биологической визуализации. По сравнению с ранее использовавшимися синтетическими макромолекулами, наши PicoRulers не только биосовместимы. Они также обеспечивают беспрецедентную точность для тестирования. реалистичные условия.

Открывая путь к изучению сложных процессов в клетках

Применение этой технологии выходит за рамки традиционных границ микроскопии. «Наши PicoRulers — это не только инструмент для проведения более точных измерений, но они также открывают двери для более глубокого и детального исследования сложных процессов, происходящих внутри наших клеток», — объясняет Герти Билье.

Фотофизическая оценка PicoRulers на основе PCNA и ДНК-оригами. а, б) Избранные изображения dSTORM трехмаркированных PicoRulers (DOL ≈ 3,0) и (б) ДНК-оригами (DOL ≈ 3,0) с межфлуорофорными расстояниями 6 нм, а также их одномеченых эталонных образцов (ссылка). Хотя каждое ДНК-оригами содержит один флуорофор, эталонный образец PCNA имеет DOL ≈0,4 и, следовательно, также содержит немеченые и дважды меченные молекулы PCNA (размер пикселя 2 нм). Масштабные линейки, 10 нм. в) Относительное возникновение времени жизни выключенного состояния, количество состояний (событий), обнаруженных отдельными PicoRulers в экспериментах dSTORM, и количество событий (локализаций), обнаруженных на кадр, как функция времени (анализ отпечатков пальцев). d) FLIM-изображения PicoRulers, меченных H-Tet-Cy5 (эталонный образец с индивидуальной меткой показан серым цветом, а измеренная PicoRuler, измеренная тройным щелчком мыши, показана в пурпурной рамке) с помощью конфокальной визуализации TCSPC в буфере с переключением фото при интенсивности облучения ≈ 2,5. кВт см-2. Чтобы минимизировать фотообесцвечивание флуорофора, изображения FLIM записывались со временем интегрирования 25 мкс для каждого пикселя. Порог серьезности не применялся. Масштабные линейки, 2 мкм. E) Среднее затухание флуоресценции PCNA PicoRulers, меченных одним (серым) или тремя (фиолетовыми) флуорофорами Cy5. f) Соотношения Nc/Nl,av, определенные для эталонных молекул PCNA с одной меткой и PicoRulers с тройной меткой в ​​экспериментах по сопротивлению сбору фотонов (n = 13) — Advanced Materials.

Большой потенциал для будущих приложений

Дальнейшее развитие PicoRulers может в долгосрочной перспективе изменить биологические и медицинские изображения с молекулярным разрешением. Впервые стало возможным проверить и улучшить потенциал разрешения новых методов микроскопии сверхвысокого разрешения на биологических образцах. Это делает его ценным инструментом для выяснения молекулярной организации и взаимодействия биомолекул в клетках в будущем.

PCNA как наномасштаб на основе белка для флуоресцентной визуализации с длиной волны менее 10 нмРасширенные материалы (открытый доступ)

Астробиология